So erkennen Sie Mykoplasmen mit einem Abstrich

Der Nachweis von Mycoplasma mit einem Abstrich umfasst in der Regel mehrere Schritte, darunter Probenentnahme, DNA-Extraktion und molekulare Tests. Hier ist ein allgemeiner Ablaufplan:

Benötigte Materialien:

• Sterile Tupfer
• Transportmedium (z. B. PBS oder spezifisches Mycoplasma-Transportmedium)
• DNA-Extraktionskit
• PCR-Reagenzien und Zubehör
• Spezifische Primer für den Mycoplasma-Nachweis
• Gelelektrophorese-Gerät oder Echtzeit-PCR-Maschine

Schritt-für-Schritt-Anleitung:

1. Probenentnahme:

1. Zubereitung:

• Tragen Sie sterile Handschuhe und wenden Sie aseptische Techniken an.
• Stellen Sie sicher, dass die Tupfer und das Transportmedium steril und gebrauchsfertig sind.

1. Abstrich:

• Reiben Sie den Tupfer vorsichtig über den verdächtigen Bereich (z. B. Zellkultur, Rachen, Urogenitalbereich), um die Probe zu entnehmen.
• Um die Probe zu konservieren, legen Sie den Tupfer sofort in das Transportmedium.

2. DNA-Extraktion:

1. Lyse:

• Übertragen Sie den Tupfer in ein Röhrchen mit Lyse-Puffer aus dem DNA-Extraktionskit.
• Gemäß den Anweisungen des Kits inkubieren, um die Zellen zu lysieren und DNA freizugeben.

1. Reinigung:

• Befolgen Sie das Protokoll des DNA-Extraktionskits, um die DNA zu reinigen. Dies beinhaltet normalerweise das Binden der DNA an eine Säule, das Auswaschen von Verunreinigungen und das Eluieren der gereinigten DNA.

3. PCR (Polymerase-Kettenreaktion):

1. PCR-Mix vorbereiten:

• Bereiten Sie einen Mastermix vor, der Folgendes enthält:
  • DNA-Vorlage (aus dem Extraktionsschritt)
  • Mycoplasma-spezifische Primer
  • dNTPs
  • Taq-Polymerase
  • Pufferlösung

1. Verstärkung:

• Richten Sie die PCR-Maschine mit den entsprechenden Zyklusbedingungen ein (normalerweise anfängliche Denaturierung, gefolgt von Denaturierungs-, Annealing- und Verlängerungszyklen).

1. Erkennung:

• Für die Endpunkt-PCR führen Sie die amplifizierten Produkte auf einem Agarosegel aus und färben sie mit einem DNA-bindenden Farbstoff (z. B. Ethidiumbromid), um Bänder unter UV-Licht sichtbar zu machen.
• Überwachen Sie bei der Echtzeit-PCR die Amplifikation in Echtzeit mithilfe eines fluoreszierenden Farbstoffs oder einer fluoreszierenden Sonde.

Interpretation der Ergebnisse:

• Positives Ergebnis:
• Das Vorhandensein spezifischer Bänder bei der Gelelektrophorese oder eines positiven Signals bei der Echtzeit-PCR weist auf das Vorhandensein von Mycoplasma-DNA hin.
• Negatives Ergebnis:
• Das Fehlen spezifischer Bänder oder kein Amplifikationssignal weist auf das Fehlen von Mycoplasma-DNA hin.

Weitere Überlegungen:

• Regler:
• Nehmen Sie zur Validierung der Ergebnisse positive und negative Kontrollen in Ihre PCR auf.
• Kontaminationsprävention:
• Verwenden Sie separate Bereiche für die Probenvorbereitung, PCR-Einrichtung und Analyse, um Kontaminationen zu vermeiden.
• Reinigen Sie Arbeitsflächen und Geräte regelmäßig mit DNA-abbauenden Mitteln.

Dieser Prozess gewährleistet eine genaue Erkennung von Mycoplasma in Ihren Proben. Befolgen Sie bei klinischen Anwendungen immer die von den zuständigen Gesundheitsbehörden und -institutionen empfohlenen Richtlinien und Protokolle.