Verfahren zur Extraktion von Nukleinsäuren

Die Nukleinsäureextraktion ist ein grundlegender Schritt in der Molekularbiologie und bei diagnostischen Tests und ermöglicht es Forschern und medizinischem Fachpersonal, DNA oder RNA aus verschiedenen biologischen Proben für die anschließende Analyse zu isolieren. Hier ist eine Übersicht über den Nukleinsäureextraktionsprozess:

Beispielsammlung: Der Prozess beginnt mit der Sammlung biologischer Proben, die die Zielnukleinsäuren enthalten. Zu den Proben können je nach konkreter Anwendung Blut, Gewebe, Speichel, Abstriche, Urin oder andere Körperflüssigkeiten gehören.

Probenlyse: Die gesammelten Proben werden lysiert, um die Zellen aufzubrechen und die Nukleinsäuren freizusetzen. Lysepuffer, die Detergenzien, chaotrope Wirkstoffe oder Enzyme enthalten, werden typischerweise verwendet, um Zellmembranen aufzubrechen und Proteine ​​abzubauen, wodurch der Zugang zu den Nukleinsäuren ermöglicht wird.

Nukleinsäurebindung: Sobald die Nukleinsäuren in das Lysat freigesetzt werden, müssen sie selektiv an eine Festphasenmatrix wie Silica-Membranen oder Magnetkügelchen gebunden werden. Die Wahl der Bindungsmatrix hängt von Faktoren wie Probentyp, Nukleinsäuretyp (DNA oder RNA) und nachgelagerten Anwendungen ab.

Waschen: Nach der Bindung wird die Festphasenmatrix gewaschen, um Verunreinigungen wie Proteine, Lipide und andere Zelltrümmer zu entfernen. Waschschritte tragen zur Reinigung der Nukleinsäuren bei und reduzieren das Hintergrundrauschen in nachfolgenden Analysen.

Elution: Die gereinigten Nukleinsäuren werden anschließend mit einem salzarmen Puffer oder Wasser von der Festphasenmatrix eluiert. Durch die Elution werden die Nukleinsäuren in eine saubere Lösung freigesetzt, die für nachfolgende Anwendungen wie PCR (Polymerase-Kettenreaktion), Sequenzierung oder andere molekulare Tests bereit ist.

Qualitätskontrolle: Extrahierte Nukleinsäuren können Qualitätskontrollschritten unterzogen werden, um ihre Konzentration, Reinheit und Integrität zu bewerten. Zu den gängigen Quantifizierungsmethoden gehören UV-Spektroskopie (z. B. mit einem Spektrophotometer) oder Fluorometrie (z. B. mit einem fluoreszenzbasierten Assay). Die Reinheit wird häufig durch Messung des Absorptionsverhältnisses bei bestimmten Wellenlängen beurteilt (z. B. A260/A280-Verhältnis für DNA oder A260/A230-Verhältnis für RNA). Die Integrität kann durch Gelelektrophorese oder Kapillarelektrophorese bewertet werden.

Lagerung: Gereinigte Nukleinsäuren können je nach Verwendungszweck und Stabilitätsanforderungen bei geeigneten Temperaturen (-20 °C oder -80 °C) für die Kurz- oder Langzeitlagerung gelagert werden.

Es ist wichtig zu beachten, dass die Protokolle zur Nukleinsäureextraktion je nach spezifischem Probentyp, gewünschtem Nukleinsäuretyp, nachgelagerten Anwendungen und verfügbaren Geräten oder Kits variieren können. Forscher und Laborpersonal optimieren häufig Extraktionsprotokolle, um hohe Ausbeuten, Reinheit und Integrität der extrahierten Nukleinsäuren für eine zuverlässige nachgelagerte Analyse zu erreichen. Darüber hinaus sind Automatisierungs- und Kit-basierte Ansätze immer häufiger anzutreffen, um den Extraktionsprozess zu rationalisieren und zu standardisieren, insbesondere in Laborumgebungen mit hohem Durchsatz.

Verfahren zur Extraktion von Influenzavirus-Nukleinsäuren

Der Nukleinsäureextraktionsprozess für Influenzaviren folgt typischerweise einem ähnlichen Arbeitsablauf wie die allgemeine Nukleinsäureextraktion, mit einigen spezifischen Überlegungen für das Virus und die zu verarbeitenden Proben. Hier ist eine Übersicht über den Nukleinsäureextraktionsprozess für Influenzaviren:

Probenentnahme: Nasopharyngeale Abstriche, Nasenspülungen, Rachenabstriche oder Atemwegssekrete werden häufig von Personen entnommen, bei denen der Verdacht auf eine Grippeinfektion besteht.

Probeninaktivierung: Um die biologische Sicherheit zu gewährleisten und eine Virusübertragung zu verhindern, können gesammelte Proben mit einem geeigneten Virusinaktivierungspuffer oder einer Wärmebehandlung behandelt werden, um das Virus nicht infektiös zu machen und gleichzeitig Nukleinsäuren für die Extraktion aufzubewahren.

Probenlyse: Die inaktivierten Proben werden lysiert, um virale RNA freizusetzen. Lysepuffer, die Detergenzien, chaotrope Mittel oder Enzyme enthalten, werden verwendet, um Virushüllen aufzubrechen und virale Nukleinsäuren freizusetzen.

Nukleinsäurebindung: Nach der Lyse wird virale RNA durch einen Prozess, der typischerweise chaotrope Salze und Ethanol umfasst, selektiv an eine Festphasenmatrix wie Silica-Membranen oder Magnetkügelchen gebunden. Dieser Schritt ermöglicht die Reinigung und Konzentration viraler RNA.

Waschen: Die Festphasenmatrix, die gebundene virale RNA enthält, wird gewaschen, um Verunreinigungen wie Proteine, Zelltrümmer und Inhibitoren zu entfernen, die nachfolgende Anwendungen beeinträchtigen können.

Elution: Die gereinigte virale RNA wird mit einem salzarmen Puffer oder Wasser von der Festphasenmatrix eluiert. Durch die Elution wird die virale RNA in eine saubere Lösung freigesetzt, die für die anschließende Analyse wie die Reverse-Transkriptions-Polymerase-Kettenreaktion (RT-PCR) zum Nachweis und zur Charakterisierung von Influenzaviren bereit ist.

Qualitätskontrolle: Extrahierte virale RNA kann Qualitätskontrollschritten unterzogen werden, um ihre Konzentration, Reinheit und Integrität mithilfe von Methoden wie UV-Spektroskopie, Fluorometrie oder RT-PCR zu bewerten.

Lagerung: Gereinigte virale RNA kann je nach Verwendungszweck und Stabilitätsanforderungen bei geeigneten Temperaturen (-20 °C oder -80 °C) zur kurz- oder langfristigen Lagerung gelagert werden.

Es ist wichtig zu beachten, dass der Nukleinsäureextraktionsprozess für Influenzaviren je nach Faktoren wie dem spezifischen Probentyp, der Viruslast, der verwendeten Nachweismethode und der verfügbaren Ausrüstung oder Kits variieren kann. Darüber hinaus sollten die Vorsichtsmaßnahmen zur biologischen Sicherheit strikt befolgt werden, um eine Virusübertragung während der Probenverarbeitung zu verhindern. Automatisierte Extraktionsplattformen und kommerzielle Extraktionskits, die speziell für den Nachweis von Influenzaviren entwickelt wurden, werden häufig verwendet, um den Extraktionsprozess in klinischen Labors und Forschungslabors zu rationalisieren und zu standardisieren.