Welche Schritte sind für die PCR-Extraktion erforderlich?

PCR (Polymerase-Kettenreaktion) ist eine Technik zur Amplifikation von DNA-Sequenzen. Der Prozess selbst wird PCR-Amplifikation und nicht Extraktion genannt, beinhaltet aber oft zunächst die DNA-Extraktion aus Zellen oder Geweben. Hier sind die allgemeinen Schritte der PCR:

1. DNA-Extraktion

Vor der PCR muss die DNA aus den Zellen extrahiert werden. Dies umfasst mehrere Schritte:

a. Beispielsammlung

• Sammeln Sie Zellen oder Gewebe von der Quelle (z. B. Blut, Speichel, Gewebebiopsie).

b. Zelllyse

• Brechen Sie die Zellen auf, um die DNA freizugeben. Hierzu verwenden Sie physikalische Methoden (wie Mahlen oder Beschallung) oder chemische Methoden (mithilfe von Reinigungsmitteln und Enzymen).

c. DNA-Reinigung

• Entfernen Sie Proteine ​​und andere Verunreinigungen mithilfe einer Phenol-Chloroform-Extraktion, einer Ethanolfällung oder handelsüblicher DNA-Extraktionskits.

2. PCR-Amplifikation

Sobald Sie die gereinigte DNA haben, können Sie mit der PCR-Amplifikation fortfahren:

a. Vorbereitung der PCR-Reaktionsmischung

• Template-DNA: Die extrahierte DNA, die die zu amplifizierende Zielsequenz enthält.
• Primer: Kurze einzelsträngige DNA-Sequenzen, die komplementär zu den flankierenden Sequenzen der Ziel-DNA-Region sind.
• dNTPs (Desoxynukleotidtriphosphate): Die Bausteine ​​für die Synthese neuer DNA-Stränge.
• Taq-DNA-Polymerase: Ein hitzebeständiges Enzym, das die neuen DNA-Stränge synthetisiert.
• Pufferlösung: Behält den optimalen pH-Wert und die optimale Ionenstärke für die Reaktion bei.
• MgCl₂: Ein Cofaktor, der für die Aktivität der Taq-Polymerase erforderlich ist.

b. Thermocycling-Schritte

Das PCR-Reaktionsgemisch wird in einen Thermocycler gegeben, der die Temperatur zyklisch ändert. Die wichtigsten Schritte in jedem Zyklus sind:

• Denaturierung (94-98°C): Die doppelsträngige DNA schmilzt zu Einzelsträngen auf.
• Tempern (50-65°C): Die Primer binden (annealen) an ihre komplementären Sequenzen auf der einzelsträngigen DNA.
• Verlängerung (72°C): Taq-Polymerase fügt den Primern dNTPs hinzu, verlängert den DNA-Strang und synthetisiert den neuen komplementären Strang.

c. Radfahren

• Der Thermocycler wiederholt diese Schritte 20–40 Zyklen lang, was zu einer exponentiellen Amplifikation der Ziel-DNA-Sequenz führt.

3. Post-PCR-Analyse

Nach der PCR-Amplifikation können die Produkte mit verschiedenen Methoden analysiert werden:

• Gel-Elektrophorese: Um die amplifizierten DNA-Fragmente zu visualisieren.
• Die Sequenzierung: Um die genaue Sequenz der amplifizierten DNA zu bestimmen.
• Quantifizierung: Verwenden Sie Methoden wie qPCR (quantitative PCR), um die DNA-Menge zu messen.

Dies sind die allgemeinen Schritte der PCR, von der DNA-Extraktion bis zur Amplifikation und Analyse. Die spezifischen Details können je nach Anwendung und Art der durchgeführten PCR variieren.